小鼠皮下成瘤实验：解锁肿瘤研究的“迷你实验室”
小鼠皮下成瘤是一类经典的体内实验模型，广泛用于研究肿瘤细胞的生长特性、药物筛选以及抗肿瘤机制等。但在实际操作中，模型的建立却往往面临诸多挑战，那么今天我们就带大家好好地盘一盘，看看怎样才能成功建立起这个模型。
01 实验材料准备
1.实验动物
通常选用免疫缺陷小鼠，如裸鼠（nu/nu）或严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异，建议根据预实验结果选择合适的动物模型，同时参考已发表的文献。
选择小鼠周龄不宜过大，如，裸鼠8周龄以上NK细胞等免疫细胞活力开始增强，一般来说，4～6周龄的裸鼠更容易成瘤，这时免疫系统不够强，成瘤率相对较高。
2.细胞选择
根据实验目的选择合适的肿瘤细胞株。
02 实验步骤
1.细胞准备
收集指数生长期、密度在80-90%的肿瘤细胞，至无菌离心管中。细胞在4℃，1500rpm离心5min，去除上清液并将细胞均匀重悬于1mL PBS中，离心清洗2-3遍。
使用胰酶消化细胞。加入PBS或无血清培养基制成细胞悬液，离心清洗1-2次去除胰酶，重悬至终浓度为1-5×108个细胞/mL（供参考，可根据实际情况进行调整），置于冰盒中。
2.细胞接种
接种部位选择：通常选择小鼠右侧或左侧腋窝下或背部皮下。一般认为腋下皮下血供充足，利于肿瘤细胞增殖，且右侧操作较方便。
如果个别瘤种生长速度较快，可以接种后肢或背部等供血量不是特别充足的地方，或者降低细胞接种剂量，减缓肿瘤生长速度。
接种：将上一步的细胞悬液与基质胶按1：1混合，制备成终浓度为1-5×107个/mL的细胞悬液，用1mL注射器吸取0.1mL细胞悬液（约含1-5×106个细胞）。
在接种前，使用枪将细胞悬液充分吹散，以确保细胞均匀分散，防止细胞聚集并降低其存活率。
在小鼠皮下缓慢注射，注射过程中要保持针头稳定，避免细胞外漏。
接种操作：接种时，用拇指和食指抓住小鼠肩膀上的皮肤，防止小鼠将注射器踢开，使其保持在直立位置。用75%乙醇棉球轻轻消毒皮肤2-3次。轻轻地将针插入皮肤以到达皮下。
轻轻推入注射器中的细胞，在拔出针头之前停留几秒钟，以防细胞悬液漏出。
3.肿瘤生长监测
接种后将小鼠放回笼中饲养，每天观察小鼠的精神状态、饮食情况以及接种部位肿块出现和生长情况。大约1周-1月左右可看到肿瘤出现。
肿瘤体积测量：从第3天开始，每隔2天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=（a×b²）/2计算肿瘤体积。
体重测量：定时测量小鼠体重，记录体重变化情况。
4.终止与取材
终止标准：当肿瘤体积达到1000mm³时对小鼠进行安乐死。
取材：用剪刀剪开皮肤，完整取出肿瘤组织。将一部分冻存于液氮中，以备将来提取蛋白质和RNA使用；另一部分则放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续的组织学分析。
03 注意事项
1.无菌操作：整个实验过程需在超净工作台内进行，严格遵守无菌操作原则。细胞培养操作过程要注意防止污染。支原体污染极为常见，会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，从而影响肿瘤生长和结果的可重复性。建议接种前对细胞进行支原体检测。
2.细胞状态：确保细胞在注射前处于良好的生长状态，无污染，细胞活性大于90%。细胞活力是影响肿瘤形成的重要原因，接种细胞建议取处于对数期生长的细胞，接种前对细胞活率进行检测，接种过程中细胞置于冰上，保持低温，接种完成后也可以留一小部分细胞检测细胞活率，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。另外，注意避免体外过度传代影响细胞状态（一般3-5代）。
3.接种技巧：接种时要缓慢，避免细胞团块形成。注射前，一定要排去针管内的空气。在接种时，针头应深入皮下约1厘米，以减少注射后细胞悬液从针眼溢出的可能性。注射时，针头应向前方穿行，且在注射前轻微移动针头，以确保针头处于皮下。如果针头能够移动，则表明它在皮下位置，否则可能在皮内或肌肉内。保证每只小鼠接种的细胞数一致。
04 结果分析
1.肿瘤生长曲线绘制：以时间为横坐标，肿瘤体积为纵坐标，绘制肿瘤生长曲线。通过比较不同组别的肿瘤生长曲线，可以直观地观察到肿瘤的生长趋势。
2.肿瘤重量分析：将取出的肿瘤组织称重，计算平均肿瘤重量，比较不同组别之间的差异。
3.组织学分析：对固定后的肿瘤组织进行石蜡包埋、切片、HE染色等处理，观察肿瘤的组织结构、细胞形态以及血管生成等情况。
05 常见问题
1.肿瘤不生长或生长缓慢
原因：可能是细胞活性不足、注射部位不准确或小鼠个体差异等原因。
解决方法：确保细胞在注射前处于良好的生长状态，调整注射部位和注射技巧，选择健康的小鼠进行实验。
2.肿瘤坏死或感染
原因：可能是注射过程中细胞外漏、注射量过多或小鼠感染等原因。
解决方法：严格控制注射量，避免细胞外漏，加强小鼠饲养环境的卫生管理，及时处理感染的小鼠。
3.小鼠死亡率过高
原因：可能是麻醉剂量过大、肿瘤生长过快导致小鼠负担过重或实验操作不当等原因。
解决方法：准确控制麻醉剂量，定期监测小鼠的肿瘤生长情况，及时终止实验，避免实验操作对小鼠造成不必要的伤害。
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