Cell Counting Kit (CCK-8)

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产品简介

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒,是一种基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品,工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。CCK-8法应用非常广泛,如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

 

产品规格

货号

C331301E

C331301S

C331301M

C331301L

C331301T

规格

100 T

500 T

1000 T

3×1000 T

10×1000 T

 

运输与储存

2-8干燥避光储存,有效期1年。-20℃干燥避光保存,有效期2年。冰袋运输。

 

操作注意

  1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
  2. 有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。
  3. 白细胞可能需要培养较长时间。
  4. 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000 /(100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2500/(100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
  5. 如果没有450 nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。
  6. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
  7. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  8. 本产品仅作科研用途!

操作说明

 

  1. 制作标准曲线(测定细胞具体数量)

a先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞到培养板内

b按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。

c接种后培养2-4 h使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)

  1. 细胞活性检测

a96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间37℃,5% CO2)。

b向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

c将培养板在培养箱内孵育1-4 h

d用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

e若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h内测定,吸光度不会发生变化。

  1. 细胞增殖-毒性检测

a96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 h375% CO2)。

b向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

c将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6122448 h)。

d向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

e将培养板在培养箱内孵育1-4 h

f用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

g若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 h内测定,吸光度不会发生变化。

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

  1. 活力计算

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

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