Universal One Step RT-qPCR Fluore Green Kit；通用一步法RT-qPCR染料法预混液

产品简介

Universal One Step RT-qPCR Fluore Green Kit是一款基于SYBR Green I染料进行荧光定量的试剂盒。使用基因特异性引物，反转录和qPCR反应在一管内完成，无需反复开盖和移液，大大提高检测效率，降低了污染风险。缓冲体系经过优化，对于高表达的靶标, 试剂盒灵敏度可以达到0.1 pg，中等表达的靶标，可以达到1 pg。本试剂盒同时也适用于DNA样本的扩增定量。本试剂盒可实现不同动植物样本、细胞、微生物核酸的高灵敏检测和定量。

 

产品信息

货号	N132051E	N132051S
规格	20 T（20 μL/rxn）	200T（20 μL/rxn）

 

组分信息

组分编号	组分名称	N132051E	N132051S
N132051-A	2×RT-qPCR Buffer	250 μL	2×1.25 mL
N132051-B	RT-qPCR Enzyme Mix	20 μL	200 μL
N132051-C	RNase free H2O	250 μL	2×1.25 mL

 

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期1年。

 

注意事项

1. 加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

2. 每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅用于科研。

 

使用说明

一、推荐反应体系

表1 反应体系*****

组分	体积（μL）****	体积（μL）	终浓度
2× Universal SG Buffer	12.5	25	1×
Universal UH Enzyme Mix	1	2	-
Forward Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)**	0.5	1	0.2 μM
模板 RNA***	X	X
RNase-free ddH2O	to 25	to 50

【注】：** 通常引物终浓度为0.2 μM，也可根据情况在0.1-1 μM之间进行调整。

*** 该试剂灵敏度极高，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源样本测试显示最佳投入量为1 pg – 100 ng，控制Ct值整体在15-30之间为宜。

**** 推荐使用20 μL或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

***** 请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

二、反应程序

表2 标准扩增程序

循环步骤	温度	时间	循环数
反转录	50℃*	6 min	1
预变性	95℃	5 min	1
扩增反应	95℃	15 sec	40
	60℃**	30 sec
熔解曲线	仪器默认设置		1

【注】：* 反转录温度可根据实验需求在50-55℃之间进行选择。对于DNA样本，反转录过程可省去。

** 特殊情况下退火/延伸温度可根据引物Tm值进行调整，建议使用60℃。

 

三、适用机型

不需要Rox校正的仪器型号：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;

Low Rox适用机型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

High Rox适用机型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.

 

四、引物设计技巧

1. 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增到假阳性的风险。

2. 引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

3. 引物长度一般在18~27 bp，不应过长否则导致其延伸温度过高，不适于Taq DNA 聚合酶反应。

4. 引物GC含量在40%~60%，GC含量过高或过低都不利于反应。上下游引物GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通过软件计算引物Tm值。

5. PCR产物的长度通常控制在80-300 bp,为了保证扩增效率，在设计引物时要考虑PCR产物的长度。

6. 引物3′端末端尽量避免为A，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

7. 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

8. 引物自身及引物之间避免存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其DG值不要过高（应小于4.5 kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 

 

五、异常结果分析

1. 无Ct值出现

采集荧光信号的步骤有误：在退火/延伸结束采集信号；

引物降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

模板量不足：对未知浓度的样品应从原液开始测试；

模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值偏大 (Ct >35)

扩增效率低：反应条件不够优化，引物设计存在问题，可试用三步法进行反应，也可适当降低退火温度；

PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳

a.  加样存在误差：使得标准品不呈梯度；RNA模板推荐使用1×TE缓冲液进行梯度稀释，DNA模板推荐使用ddH2O稀释;

b.  标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

c.  引物设计不佳：重新设计引物；

d.  模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

4. NTC有扩增（Ct<32）

a.  引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

b.  引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

c.  气溶胶污染：扩增产物泄露很容易在实验室中引发气溶胶污染，一旦污染，定量检测结果就会不准确。