1st Strand cDNA Synthesis Kit (for PCR/qPCR)；一链cDNA合成试剂盒（用于PCR/qPCR）

产品简介

1st Strand cDNA Synthesis Kit（for PCR/qPCR）是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。其中的酶，合成cDNA速度快，热稳定性高，可耐受最高60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录；同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的反转录；最长可合成长达19.8 kb的cDNA。

本试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的gDNA污染；提供两种cDNA合成引物，Random Primers N6和Oligo (dT)18，用户可按需选择，或使用Gene Specific Primers作为引物。试剂盒合成的单链cDNA可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品信息

货号	N132065E	N132065S
规格	10 T	100 T

组分信息

组分编号	组分名称	N132034E	N132034S
N132065-A	RNase-free H2O	1 mL	2×1 mL
N132065-B	5×DNA digester Mix	30 μL	300 μL
N132065-C	10×Super Buffer*	20 μL	200 μL
N132065-D	RT Enzyme Mix**	10 μL	100 μL
N132065-E	Random Primers N6 (50 μM)	10 μL	100 μL
N132065-F	Oligo (dT)18 (50 μM)	10 μL	100 μL

*10×Super Buffer包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

**RT Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期18个月。

注意事项

1，反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2，建议RNA溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3，5×gDNA digester Mix、10×Super Buffer、RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。

4，qPCR 实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。

5，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6，本产品仅用于科研。

使用说明

1，关于逆转录引物的选择

1）如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18，与真核生物mRNA的3’PolyA尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2，第一链 cDNA 合成操作步骤

1）若实验需要去除残留基因组 DNA

a，gDNA消化

在 RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

表1  gDNA消化体系*

组分	使用量
RNase-free H2O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg-5 μg*
or mRNA	10 pg-500 ng*

*若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10 pg -1 μg；mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b，逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表2 逆转录体系(以 20 μL为例)*

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Super Buffer	2 μL
RT Enzyme Mix	1 μL
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
	or 1 μL
RNase-free H2O	to 20 μL

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

1）逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 以1:1混合使用。

2）建议先加入10×Super Buffer 混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c，逆转录标准程序设置

表3 逆转录标准程序*

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d，逆转录快速程序设置

表4 逆转录快速程序*

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e，产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

2）若实验无需去除残留基因组 DNA

a，RNA模板变性

在 RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育 5 min，迅速置于冰上，并静置 3 min。

表5  RNA模板变性体系

组分	使用量
RNase-free H2O	To 17 μL
Total RNA	10 pg -5 μg
or mRNA	10 pg-500 ng
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
or Oligo (dT)18 (50 μM) or Gene Specific Primer (2 μM)	or 1 μL
	or 1 μL

b，逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表6 逆转录体系(以20 μL为例)*

组分	使用量
上一步的反应液	17 μL
10×Super Buffer	2 μL
RT Enzyme Mix	1 μL

c，逆转录标准程序设置

表7 逆转录标准程序*

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃，对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐 15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d，逆转录快速程序设置

表8 逆转录快速程序*

温度	时间
55℃	15 min
85℃	5 sec

*逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e，产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

3）miRNA 第一链 cDNA 茎环法合成操作步骤

a，gDNA消化

在 RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

表9  gDNA消化体系

组分	使用量
RNase-free H2O	To 15 μL
5×gDNA Digester Mix	3 μL
Total RNA	10 pg -5 μg

b，miRNA逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表10  miRNA 逆转录体系(以20 μL为例)*

组分	使用量
上一步的反应液	15 μL
10×Super Buffer	2 μL
RT Enzyme Mix	1 μL
Gene Specific Primer (10 μM)	1 μL
RNase-free H2O	to 20 μL

*1）建议先加入10×Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c，miRNA 逆转录标准程序设置

表11  miRNA 标准扩增程序*

温度	时间
25℃	5 min
55℃	15 min
85℃	5 min

*逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。