类器官是指利用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等在体外培养的三维细胞结构，它们展现出空间结构和类似组织的排列。2021年，类器官技术被中国“十四五”规划确定为重点研发方向之一。作为疾病模型，与传统的二维疾病模型相比，类器官更接近体内环境，因此在细胞治疗、药物开发、遗传工程、免疫学和组织再生等领域至关重要。
以下内容将指导您完成培养小鼠肠道类器官的整个过程，并强调相关注意事项，以尽量减少培养过程中的陷阱。
实验材料
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Product Type |
Product Name |
Catalog Number |
Specifications |
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Intestinal Tissue Digestion |
C231131 |
30ml |
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Organoid Culturing Support |
Arcegel Matrix for Organoid culture, Phenol Red-Free, LDEV-Free |
C231009 |
5 mL |
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Culture Medium Components and Additives |
C231114 |
500ml |
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C230135 |
500ml |
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Recombinant Human RSPO1 Protein |
C230254 |
100ug |
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Recombinant Human Noggin Protein, His Tag |
C230462 |
100ug |
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Recombinant Human EGF Protein |
C230328 |
100ug |
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Recombinant Human Wnt -3a Protein |
C230259 |
100ug |
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Organoid Collection |
Cell recovery solution for Organoid |
C231103 |
30mL |
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Organoid Cryopreservation |
C231104 |
30mL |
小肠类器官培养方法
1、样本准备
通过颈椎脱位的方式对小鼠实施安乐死，并用酒精对表面进行消毒。
在无菌条件下，从距离胃部3到15厘米的小肠中提取肠道组织，使用镊子仔细去除肠系膜和脂肪，将其放入含有1%抗生素/抗真菌剂的DPBS溶液中，并置于4°C下保存。
2、样本清洗
使用注射器将肠道冲洗2-3次，然后仔细用手术剪刀剪开肠管，将腔面朝上放置。
使用手术刀片轻轻刮除腔面上的绒毛，直到组织变得透明。在含有DPBS的新培养皿中清洗肠道组织2-3次。
3、样本初步处理
将清洗干净的小肠组织切成2毫米宽的小块，并转移到一个新的50毫升离心管中。
用DPBS轻轻冲洗组织3-5次，以去除绒毛细胞和浮动的脂肪组织。
4、组织消化
向清洗干净的小肠组织块中加入10-15mL预冷的含有3-5mM EDTA的DPBS溶液，并在4°C下消化约30分钟，每10分钟轻轻摇动试管。
消化后，倒掉EDTA溶液，并用新鲜的DPBS轻轻冲洗组织2-3次，以去除残留的EDTA。
向小肠组织块中加入10-15mL预冷的含有0.1% BSA的DPBS溶液，反复用移液管抽吸和悬浮组织碎片，以分离隐窝细胞。
当观察到大量类似隐窝的结构时停止抽吸，然后通过70μm滤网过滤组织悬液，并收集通过滤网的组织悬液。
5、混合物制备
将隐窝沉淀重新悬浮在Arcegel基质凝胶中，每10μL基质凝胶悬液中含有200-600个隐窝。
将混合悬液置于冰上，并迅速进行下一步操作，以避免基质凝胶凝固。
将基质凝胶悬液稀释至≥50%的稀释比例，以确保Arcegel基质凝胶结构在培养过程中的稳定性。
将混合悬液种植在24孔板底部中心，每个孔约30-50μL，避免接触板壁。
6、培养
将板放置在37°C CO2培养箱中约30分钟，直到Arcegel基质凝胶完全固化。
Arcegel基质凝胶完全固化后，沿着孔壁缓慢加入预先准备的小肠类器官培养基，每个孔约800μL。
将24孔板放置在37°C CO2培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基，并监测类器官的生长情况。通常，小鼠小肠类器官在5-7天内形成。
实验结果
Figure Ex vivo culture results of mouse small intestinal organoids.
小肠类器官传代
在培养5-7天或当小肠类器官中心变黑时，可以进行传代。预先在培养箱中预热24孔或12孔板至少30分钟。移除旧培养基，每个孔加入1mL冷DPBS，等待1分钟，轻轻提起Arcegel，用1毫升移液管尖端抽吸分散，用注射器吸取悬液，重复此步骤一次，将悬液转移到5mL离心管中，以1200转每分钟，4°C下离心5分钟，倒掉上清液，并按每个孔1:3的比例传代。
小肠类器官的冷冻保存
选择生长旺盛的类器官（通常在传代后3-4天）进行冷冻保存，每个冷冻管取两个孔的量。移除培养基，加入1mL细胞冷冻介质，用移液管尖端分散Arcegel，将悬液转移到冷冻管中，将冷冻管放入冷冻盒中，在-80°C下冷冻1天，然后转移到液氮中长期保存。
小肠类器官的复苏
预先在培养箱中预热24孔板30分钟。从液氮中取出冷冻管，放入37°C水浴中。一旦冷冻管内容物解冻，用1mL注射器吸取，将细胞悬液转移到15mL离心管中，以1200转每分钟，4°C下离心5分钟，倒掉上清液，加入5mL冰冷的DPBS重新悬浮，重复离心步骤，倒掉上清液。按照标准类器官培养方法进行类器官培养。
常见问题
组织消化时应选择哪种消化液，以及消化时间是多长？
对于组织的消化，可以选择EDTA或胶原酶。如果消化中空器官，EDTA是合适的，如小肠和胃。胶原酶有多种类型，可以用于多种组织类型，通常与DNase联合使用。消化时间根据组织类型而有很大差异，从几分钟到几个小时不等，根据具体产品的说明书进行操作。
培养不同孔板的类器官需要多少体积的基质凝胶和培养基？
培养类器官常用的孔板是24孔板，每个孔加入50μL的基质凝胶形成滴液，然后加入500μL的培养基覆盖滴液。对于96孔板，每个孔加入10μL的基质凝胶形成滴液，然后加入200μL的培养基覆盖滴液。在6孔板中，每个孔可以种植多个50μL的滴液，并加入2-3mL的培养基覆盖滴液。
