肠道是人体中重要的消化器官，指的是从胃的幽门到肛门的消化道，是人体中最长的消化器官。人类肠道结构主要包括小肠和大肠。肠道疾病非常普遍，如肠梗阻、慢性炎症性肠病、结直肠癌等，其中结直肠癌已成为威胁人类健康最严重的疾病之一。因此，肠道研究是一个非常热门的领域，具有广泛的应用前景。
培养流程-文献分析1
2009年，由Hans Clevers领导的研究团队首次成功地在体外培养了3D肠道“类器官”，使用的是单个干细胞（Lgr5+）或来源于肠道隐窝的单个隐窝结构。分离的肠道干细胞或隐窝能够在基质凝胶、小分子化合物、细胞添加剂和各种生长因子的作用下持续增殖，具备自我更新和分化能力。它们可以分化为各种成熟的肠道细胞，并在建立和研究肠道疾病模型中发挥重要作用。[1]
Figure 1. Efficiency of Single-Cell Colony Formation in Single Wells
1. 隐窝分离，细胞分离，和细胞培养
通常通过在4°C下用含有2 mM EDTA的PBS孵育30分钟，从小鼠小肠中释放出隐窝。分离出的隐窝计数后形成球状体。在24孔板中，加入基质凝胶和生长因子（10-50 ng/mL EGF、500 ng/mL R-spondin 1、100 ng/mL Noggin）进行孵化。
2. 细胞分选实验
分离出的隐窝在37°C下孵育45分钟，解离的细胞通过20微米细胞滤网。分选后的细胞收集在隐窝培养基中，并加入含有Jagged-1肽（1 μM）的基质凝胶中，每个孔一个细胞（96孔板中5 mL基质凝胶）。
3. 隐窝培养基
在48孔板中加入250 μL培养基，在96孔板中加入100 μL培养基，并补充小分子Y-27632（10 μM）。每隔一天添加生长因子，每4天更换一次培养基。
4. 传代
将类器官从基质凝胶中取出，机械解离成单个隐窝结构，然后转移到新鲜的基质凝胶中。传代每1-2周进行一次，分比率为1:5。
Figure 2. Establishment of Intestinal Organoid Culture System [1]
Figure 3. b, c, d depict the situations after 5 days, 14 days, and 3 weeks of cultivation respectively, while e represents a schematic diagram of crypt-like organoids.
在培养小鼠结肠类器官时，培养基需要补充包括p38 MAPK激酶抑制剂（SB-202190）、TGF-β抑制剂（A 83-01）、Rho激酶抑制剂（Y-27632）、GSK抑制剂（CHIR-99021）、Jagged-1，以及生长因子如EGF、R-spondin-1、Noggin和Wnt-3A等小分子化合物。[1] [2]
研究团队基于肠道上皮细胞的生长需求设计了这样的培养系统。Wnt信号通路对隐窝增殖至关重要，Wnt激动剂R-spondin1在体内诱导显著的隐窝增生。表皮生长因子（EGF）的信号传导与肠道增殖相关，而Noggin的转基因表达则诱导隐窝数量增加。Rho激酶抑制剂Y-27632抑制胚胎干细胞凋亡，降低细胞死亡率。细胞间的Notch信号对维持隐窝增殖至关重要，我们还提供了一种Notch激动肽（Jagged-1）。[1] [2]
文献分析2
在2022年，Hans Clevers团队创新性地引入了IL-22，以优化hSIOs培养基的成分，显著提高了肠道类器官的出芽比例，并上调了Paneth细胞的表达水平，更好地模拟了人类肠道的组成表达成分，如下图所示。
Figure 4. Cultivation of human colon (effects of small molecules Nicotinamide, SB 202190, and A 83-01 on cultivation)
Figure 5. Cultivation process of human colon adenocarcinoma cells
文献分析3
用于类器官培养和hSIOs药物刺激的培养基所需的小分子化合物、添加剂和细胞因子包括：B-27（1%）、N-乙酰半胱氨酸（1 mM）、烟酰胺（10 mM）、Alk 4/5/7抑制剂A 83-01（500 nM）、p38抑制剂SB 202190（3-10 μM）、前列腺素E2（10 nM）、CHIR-99021（3-10 μM）、Rho激酶抑制剂Y-27632二盐酸盐（10 μM）和Primocin（100 μg/mL）、BP-1-102、LY294002、MK-2206、雷帕霉素、N-2、谷氨酰胺、HEPES、青霉素/链霉素、R-Spondin、Noggin（2%）、人EGF（50 ng/mL）、人IL-22（2 ng/mL），如图6中特别说明。[3]
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Compound Name |
Product Number |
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Recombinant Human IL-22 Protein |
C230399 |
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Recombinant Mouse Interleukin-22 (Mouse IL-22) |
C230571 |
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Recombinant Human Wnt -3a Protein |
C230259 |
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Recombinant Human Noggin Protein,His Tag |
C230462 |
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Recombinant Human EGF Protein，His Tag |
C230329 |
人肠道类器官培养步骤
1、重新配制隐窝基质凝胶混合物，并在孔板中加入一定量的混合物和肠道类器官培养基（例如，对于24孔板，加入50 μL混合物和500 μL培养基）。
2、转移到层流罩下，用含有抗生素的PBS冲洗2-3次，将肠道粘膜转移到含有EDTA（2 mM）的溶液中，并在4°C下孵育大约30分钟进行小肠消化，大约1小时进行结肠消化。
3、将消化后的小肠粘膜转移到离心管中，加入PBS，充分摇匀，通过70 μm细胞滤网过滤，室温下以1000转每分钟的速度离心5分钟。结肠隐窝不需要过滤。
4、倒掉上清液，加入培养基重新悬浮沉淀物，计算隐窝数量，最佳数量约为每10 μL约10个隐窝。
5、将一定量的悬浮液加入离心管中，并在室温下离心5分钟。
6、加入预冷的基质凝胶混合物（基质凝胶：培养基 = 2:1）重新悬浮沉淀物。
7、根据一定量在预热的孔板中接种重新悬浮的沉淀物。
8、每个孔中加入一定量的预热的类器官培养基，并在37°C下培养1-2周。
人类肠道类器官传代：
9、 在培养板的每个孔中加入一定量的培养基，小心使用移液管尖端刮出基质凝胶，收集悬浮液，并转移到离心管中。
10、将需要传代的类器官放在冰上5-10分钟。
11、使用移液管尖端轻轻抽吸并破坏基质凝胶，重复该过程直到基质凝胶破碎，尽量避免气泡的产生。
12、将消化后的小肠粘膜转移到离心管中，加入PBS，充分摇匀，通过70 μm细胞滤网过滤，室温下以1000转每分钟的速度离心5分钟。结肠隐窝不需要过滤。
13、倒掉上清液，加入培养基重新悬浮沉淀物，计算隐窝数量，最佳数量约为每10 μL约10个隐窝。
14、将一定量的悬浮液加入离心管中，并在室温下离心5分钟。
15、加入预冷的基质凝胶混合物（基质凝胶：培养基 = 2:1）重新悬浮沉淀物。
16、传代可以在1:1到3:1的比例之间进行。
人类肠道类器官冷冻保存：
17、 将需要冷冻的类器官放在冰上5-10分钟。
18、收集类器官，离心后倒掉上清液。
19、加入冷冻介质重新悬浮类器官，分装到冷冻管中，并存储在-80°C。24小时后，转移到液氮中长期保存。
使用肠道类器官建立体外肠道模型极大地促进了肠道疾病发生和发展的研究。它为高通量药物筛选、新药开发、药物功能测试、靶向治疗、个性化精准医疗和再生医学提供了新的和重要的研究平台和方法。肠道类器官的出现为肠道疾病研究和治疗开辟了新的途径。
