RNA质量对PCR（尤其是RT-qPCR）实验结果的准确性和可靠性具有至关重要的影响，在进行RT-qPCR或RNA测序等实验之前，必须对RNA的完整性、纯度和浓度进行全面评估。
RNA浓度评估
核酸分子所含的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波长为260nm，但它无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸等杂质；蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，通常在280nm处有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰则在230nm处，如图1。
图1. 核酸、蛋白质、污染物的最大吸收峰（图源网络）
对于RNA的浓度来说，根据朗伯-比尔定律可计算出在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于40µg/ml的RNA[1]，即RNA的浓度（µg/µl）= OD260×40×稀释倍数/1000。比如OD260为0.16，2µl样本稀释至200µl，即稀释倍数为100，RNA的浓度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。
RNA纯度评估
一般来说，OD260/280=1.8-2.1，证明纯度较好，值得一提的是，OD260/280的比值会受到pH的影响，当用中性的水溶解RNA时候，RNA呈酸性，比值可能只有1.8-2.0之间；当用TE溶解RNA时，比值会稍偏高，可能在1.9-2.1之间。
1）OD260/280<1.8，可能有蛋白质或基因组的残留；
2）OD260/OD280 > 2.1，表明RNA有部分降解，如果直接将其反转得到的cDNA用于qPCR实验，可能会导致ct值偏大甚至没有ct值；
3）OD260/OD230 < 2.0，可能有盐离子、有机溶剂、碳水化合物等的污染，比如用trizol提取法中残留的的异硫氰酸胍会导致230nm处的吸光值升高，从而导致比值偏低。
纯度也可以通过琼脂糖琼胶电泳进行评估，如下图：
图2. RNA中有DNA（左）或蛋白质（右）的残留
由图2可看出，若泳道上部有明显的高分子量杂带，则可能是有DNA的残留，不建议用于后续的qPCR实验，会对实验的准确性造成影响（图2左）；若在胶孔处有比较亮的着色成分，则是有蛋白质的残留（图2右）。
RNA完整性评估
除了浓度、纯度外，RNA完整性也是判断RNA质量的重要指标。RNA完整性一般可通过琼脂糖凝胶电泳来进行评估。总RNA中占比达80%以上的是核糖体RNA（rRNA），因此，胶图呈现的结果主要是rRNA。
图3. 高质量RNA（左）和已降解RNA（右）的琼脂糖凝胶电泳胶图
对于真核生物来说，高质量的RNA通常有三条带，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍(图3左)，若RNA呈现弥散状，表明RNA已降解（图3右）。
附：RNA电泳注意事项：
1）电泳槽和胶板经0.5 M NaOH浸泡0.5 h去除RNase；
2）缓冲液和琼脂糖凝胶都需新配制，采用RNase-free H2O配制电泳缓冲液；
3）关于marker的选择，建议使用RNA marker；
4）RNA电泳宜使用高电压短时间的方法，以防电泳过程中RNA的降解。
相关产品
|
应用类型 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
目录价 |
|
凝胶电泳必备款 |
N132101S |
100 g |
180.00 |
|
|
N132101M |
500 g |
810.00 |
||
|
无需称量，一次一片，不用担心琼脂糖挂壁 |
N132103S |
1 BOX (200 TABLETS) |
1200.00 |
|
|
替代EB的无毒染料，适用蓝光及紫外光 |
N132109S |
500 μL |
580.00 |
