体内成像是指在活生物体中使用成像技术在细胞和分子水平上定性和定量分析生物过程和时间动态的科学学科。技术主要包括生物发光和荧光成像、同位素成像、X射线成像等。其中，生物发光利用荧光素酶基因来标记细胞或DNA，而荧光技术使用荧光蛋白(GFP、EGFP、RFP、YFP)、荧光染料等。，以标记报道基团的表达，随后使用仪器进行检测。同位素成像使用放射性同位素作为示踪剂来标记研究对象，是一种用于体内成像的示踪分析方法。通过活体成像技术，可以观察活体动物体内肿瘤生长和转移、传染病发展、特定基因表达等生物过程。生物发光在这些应用中特别实用。
Figure 1. Overlay Image of Bioluminescence, Fluorescence, and X-ray Imaging after Tumor Drug Injection (Image source: slidesplayer)
Table 1. Comparison of Different Imaging Technologies
|
|
生物发光 |
荧光 |
同位素成像 |
|
优势 |
(1)高灵敏度 (2)成像速度快，图像清晰 (3)可在体内检测到多达102个细胞 |
(1)多种蛋白质和染料是可用的 (2)利用简单的标记，多重标记是可能的 (3)适合在FACS分类中同时使用 |
(1)敏感性 (2)不影响被标记对象的行为 (3)无背景噪声 |
|
缺陷 |
(1)弱信号需要灵敏的CCD镜头 (2)对仪器的高精度要求 (3)需要标记目标细胞或基因 |
(1)非特异性荧光限制了它的灵敏度 (2)体内检测具有大约106个细胞的最低限度 (3)需要不同波长的激发光，使得体内定量困难 |
(1)相对低的空间分辨率 (2)易受辐射伤害 (3)设备相对昂贵 |
体内成像的应用范围
生物发光技术的原理如下：
生物发光技术的原理如下: 体内生物发光技术是指利用活生物体中表达的报告基因(如荧光素酶基因)产生荧光素酶蛋白，该蛋白在氧和Mg2+存在下与底物荧光素反应，消耗ATP进行氧化反应。这种反应将一些化学能转化为光能，然后被敏感的CCD设备捕获，形成离体图像。荧光素酶报告基因质粒可以插入到各种基因启动子中，成为特定基因的报告基因。通过检测报告基因，可以实现对靶基因的监测。
Figure 2. Principle of Bioluminescence In Vivo Imaging Detection
生物荧光本质上是化学荧光。在荧光素酶氧化荧光素的过程中，荧光素可以释放出波长范围很宽的可见光的光子，波长范围为460 ~ 630nm(平均波长为560 nm)。在哺乳动物中，血红蛋白是吸收可见光的主要成分，吸收了蓝绿色光范围内的大部分可见光。水和脂类主要吸收红外光，但对波长为590-800 nm的红光近红外光吸收能力都很差。因此，虽然有些散射会消耗波长超过600 nm的光，但大部分可以穿透哺乳动物组织，被高灵敏度的CCD探测器探测到。
Figure 3. Bioluminescent Imaging Detection Results
生物发光成像技术应用
|
疾病研究 |
肿瘤研究，药物代谢研究 |
|
细胞或细菌标记 |
肿瘤细胞、干细胞等的标记。生物发光和荧光蛋白的双重标记 |
|
基因变大 |
通过融合蛋白标记内源蛋白以研究基因表达 |
|
蛋白互作 |
将荧光素酶基因分成两个片段，每个片段与所研究的两种蛋白质融合，在这两种蛋白质相互作用接近时发光 |
1. 疾病研究
肿瘤学: 将荧光素酶基因插入肿瘤细胞的随机染色体位点，然后转移到动物模型中，建立各种肿瘤模型。这使得能够实时观察体内肿瘤细胞的增殖、生长和转移，使研究人员能够在接近非侵入性的条件下进行观察和研究。其高灵敏度允许检测微小的肿瘤病变(少至几百个细胞)，与传统方法相比显著提高了检测灵敏度，避免了牺牲小鼠导致的组间差异，并节省了动物成本
2. 药物研究
抗肿瘤药物研究: 通过给具有肿瘤移植物的小鼠施用不同剂量、持续时间和给药途径的抗肿瘤药物，可以观察和制定合适的给药方案和给药时间。用荧光素酶标记肿瘤细胞以建立各种可见的肿瘤模型允许实时评估各种治疗的治疗效果。它能够动态观察治疗后肿瘤细胞的变化，肿瘤细胞是否死亡，肿瘤体积是否缩小，是生物发光体内成像技术最重要的应用领域。
药物代谢研究: 标记药物代谢相关基因研究不同药物对基因表达的影响，间接了解相关药物在体内的代谢情况。在药理学研究中，可以将荧光酶报告基因质粒直接掺入载体，观察药物载体在体内的靶向器官和分布模式。在药理学研究中，可以用荧光素酶基因标记感兴趣的基因，以观察药物作用的途径。
3. 细胞标记
免疫细胞研究: 标记免疫细胞以观察免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤功能，评估免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移和其他功能。
干细胞研究: 标记组成型表达的基因，在转基因动物水平标记干细胞，并使用体内生物发光成像技术跟踪体内干细胞的增殖、分化和迁移。
细胞凋亡: 利用分子生物学方法在荧光素酶两端附着抑制发光的蛋白抑制剂(如caspase)，但在连接处加入caspase。当细胞经历凋亡时，胱天蛋白酶表达，切割抑制荧光素酶发光的蛋白质，使荧光素酶开始发光，并观察细胞的凋亡。
4. 基因表达和功能研究
基因表达与功能: 在目的基因启动子下游插入荧光素酶基因，并稳定整合到实验动物染色体中，形成转基因动物模型。该方法能够平行表达靶基因和荧光素酶，允许直接观察靶基因的表达模式，包括数量、时间、位置和影响其表达和功能的因素。
5. 蛋白互作
蛋白质相互作用: 用分离时不单独发光的荧光酶将两种不同蛋白质的C端和N端连接起来。如果这两种蛋白质相互作用，荧光酶的C-末端和N-末端将连接，激活荧光素酶的转录表达，导致在底物存在下的生物发光。在体内条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察体内环境对蛋白质相互作用的影响，这是体外实验无法模拟的。
6. 其他
生物发光的其他应用包括RNAi、蛋白质核转运等。荧光素酶基因的一端是待研究蛋白质的基因，另一端是已知在细胞核中表达的蛋白质的基因。当细胞核外的蛋白质被转运到细胞核中时，荧光素酶的N-末端和C-末端靠近在一起，恢复发光。
影响生物成像的因素
1.CCD的性能
2.实验中使用的细胞和基因的表达
3.荧光标记的选择
4.荧光素酶成像过程中底物浓度和温度的影响
5.自体荧光干涉
技术应用展望
活体成像技术使得分子生物学技术能够从体外研究转移到体内研究。因此，该技术允许在活体动物中观察基因表达和细胞活动。它具有检测灵敏度高、操作简单等优点，越来越多地应用于医学和生物学领域。其应用可总结如下:
1.了解疾病机制: 实时成像技术将基因表达和信号转导等复杂过程转化为直观的图像，使人们能够在分子和细胞水平上更好地了解疾病机制和特征。
2.疾病早期检测: 可在疾病早期检测分子和细胞变异及病理变化。
3.治疗效果的评估: 它能够在体内连续观察药物或基因治疗的机制和效果。 作为一种非侵入性的体内检测方法，活体成像技术的优势在于能够连续、快速、远距离、无损伤地获得人体分子和细胞成分的三维图像。它可以揭示病变的早期分子生物学特征，促进疾病的早期诊断和治疗，为临床诊断引入新概念。
常见问题
Q1:荧光素的钾盐、钠盐和游离酸的区别？
答:萤火虫荧光素酶的底物有三种:荧光素游离酸及其盐形式，包括钾盐和钠盐。它们之间的主要区别是: 溶解度:盐的形式更易溶于水，钾盐的溶解度为60毫克/毫升，钠盐的溶解度为100毫克/毫升。游离酸难溶于水，可以用碳酸氢钠溶液弱碱性化。 毒性:盐的形式更便于使用，特别是在体内成像实验中，因为它们可以溶于水，从而降低反应毒性。 使用效果:无显著差异。在体内实验研究中，通常优选使用钾盐。
Q2:怎样才能探测到人体发出的可见光？
答:冷却CCD镜头的高灵敏度，达到-105°C，确保即使从身体发出的非常少的光子也能被检测到。绝对密封的暗箱装置可以屏蔽所有光线，包括辐射。
Q3:CCD镜头的低温对小动物有影响吗？
答:不会，低温仅限于CCD镜头周围的小范围，其余都是室温。
Q4:与检测体内绿色荧光蛋白(GFP)的发光相比，使用荧光素进行实时成像有什么优势？
答:荧光素酶发出的红移光在组织穿透中比GFP发出的绿光强大约100倍。荧光素酶发光基于与荧光素的相互作用，提供高特异性和信噪比。GFP需要激发光产生反射光，但在检测过程中，来自小鼠皮毛和皮肤的非特异性荧光会降低信噪比。GFP检测更适合于体外检测，而荧光素酶检测更适合于体内检测。
Q5:生物发光成像技术在哪些方面优于传统技术？
答:与传统技术相比，该技术对研究肿瘤转移、基因治疗、流行病学发病机理研究、干细胞追踪、白血病相关研究等更敏感。它在肿瘤疗效研究中比传统方法更灵敏，可以通过一系列转基因动物疾病模型快速直观地进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。
Q6:如何用荧光素酶基因标记干细胞？
答:组成型表达的基因可以被标记以创造转基因小鼠，标记干细胞。造血干细胞可以从这只小鼠的骨髓中取出，并移植到另一只小鼠的骨髓中，从而能够跟踪造血干细胞的增殖、分化、迁移以及在全身的迁移过程。另一种方法是用慢病毒标记神经干细胞。
产品推荐
|
Product Name |
Catalog Number |
Specifications |
|
C331501 |
0.1/0.5/1/5g |
|
|
C331502 |
0.1/0.5/1/5 g |
|
|
ClearV Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit |
C331408 |
50/100T |
|
C331406 |
20/50/100T |
|
|
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit |
C331405 |
20/50/100T |
|
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit |
C331404 |
20/50/100T |
|
TUNEL Apoptosis Detection Kit, FITC |
C331412 |
20/50/100T |
|
TUNEL Apoptosis Detection Kit, Alexa Fluor 488 |
C331410 |
20/50/100T |
|
TUNEL Apoptosis Detection Kit, Alexa Fluor 640 |
C331411 |
20/50/100T |
